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疑难样本 | FFPE样本DNA和RNA高质量提取攻略

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FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded）样本：即福尔马林固定石蜡包埋样本，用福尔马林将组织或细胞固定后用石蜡包埋制成的样本，以供切片后用于组织学诊断及研究使用。

从FFPE样品中提取获得生物分子包括DNA、RNA和蛋白质，为科学家们打开了通往疾病研究路途上，一个藏有更多数据的宝库大门。打开这个大门的钥匙，也许正是这些帮助我们更轻松的获得FFPE样品中各种生物分子的试剂盒。

FFPE样本制备及提取流程

FFPE样本制备及核酸提取纯化流程图

FFPE样本制备及提取流程主要包括以下几个关键步骤：

1、样本采集

采集组织样本后，为避免组织离体后在外界环境中可能发生基因改变、组织自溶等变化，因此，组织从获取到固定之间的时间间隔控制得越短越好。

2、组织固定

将获得的组织置于一定浓度（一般是10%）的福尔马林溶液中。福尔马林的作用是用于组织固定，这个过程会使蛋白质之间、核酸之间、蛋白质和核酸之间发生一定程度的交联。此过程要注意把握组织的厚度，固定的时间。

3、石蜡包埋

将组织用石蜡进行包埋。此过程包含：

1）脱水，使用醇类替换水；

2）透明，使用二甲苯之类的透明剂替换掉醇类；

3）浸蜡，将组织浸入石蜡中，利用石蜡替换掉二甲苯；

4）包埋，将渗透后的组织样本浸泡在液态石蜡中，连同包埋模具一起冰冷后固化，再切割为薄片后成为固定石蜡样本，可长期保存或进行下游实验。

4、核酸提取

FFPE样本核酸提取的通用步骤为脱蜡、裂解-解交联、纯化、回收。具体步骤参照不同试剂盒说明书进行操作。

1）脱蜡

用手术刀片刮取玻片上的样本至取样管中，加入去蜡剂震荡混匀进行脱蜡暴露组织。

2）裂解-解交联

利用裂解液与蛋白酶在一定温度下进行组织裂解与解交联。

3）核酸纯化

采用不同核酸纯化方法纯化DNA或RNA。

4）回收核酸

利用洗脱液回收核酸。

FFPE样本核酸纯化步骤

5.质控

通过吸光度检测样品纯度（NanoDrop）、荧光定量（Qubit）及毛细管电泳仪进行测定核酸浓度、OD值（纯度）及片段大小（DIN）。

FFPE样本提取难题

随着分子生物学的发展，FFPE样本在分子诊断及研究的应用需求越来越多。但是由于FFPE样本保存过程中核酸已部分降解，同时DNA与组蛋白紧密交联等问题，在常规的FFPE样本核酸提取过程中，可能会遇到诸多困难。

耗时长：目前石蜡切片样本的核酸提取方法及试剂盒绝大部分还是以手工操作为主，多数均需要经过脱蜡、裂解-解交联、结合、洗涤、洗脱等步骤，整个操作流程比较繁琐且耗时在4个小时以上。

重复性低：FFPE技术无法控制不同样本的处理过程对样本的影响，这可能导致样本间差异性大，会影响结果的可靠性和数据分析的结果。

脱蜡效率低：目前常规的提取方法大多使用有机溶剂进行脱蜡，如二甲苯等，但使用二甲苯脱蜡不仅影响组织切片质量，容易造成核酸片段化和得率低，而且对人体有毒副作用，危害实验员健康，同时切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。

分离难度大：福尔马林固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。固定时间越长，交联程度越高，纯化难度越大。样本细胞形态和蛋白质结构可能会发生改变从而可能会影响病理诊断和分子生物学研究的结果和准确性。

所以，针对FFPE样本中的核酸提取需要更加快速有效的方法。

核酸提取方法

在分子生物学和临床诊断中，核酸提取是一个重要的步骤，涉及到从样本中分离和纯化DNA、RNA。传统核酸提取方法和磁珠法是两种常用的技术，它们在操作效率、安全性、成本和环境影响方面有所不同。

在生物行业各领域都追求高通量、自动化的今天，传统提取方法的局限愈来愈明显，而磁珠法提取的优势则愈来愈明显：能够实现自动化、大批量操作；操作简单、用时短；不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，安全无毒；与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。

提取FFPE样本的秘诀

1.从源头抓起，完善样本的前处理

离体时间：取材后应在30min内及时固定，防止组织变质。

样本要求：选择合适大小的组织块制作石蜡包埋组织样本，一般不超过15x10x5mm。

固定液选择：建议使用10%中性福尔马林固定液对组织进行固定，固定液应为被固定标本体积的5-10倍，并定期更换。

固定时间：根据样本情况调节固定时间，一般在24-48h为宜，固定时间过长会加重FFPE DNA的片段化。

包埋要求：选用纯净且熔点适宜的蜡，包埋要迅速，禁用明火。

切片厚度：包埋好的组织样本根据需要确定切片厚度，标准切片厚度为4μm，用于核酸提取的切片可以在10-20μm，保证切片厚度的持续稳定。

2.选择合适的提取试剂盒

工欲善其事，必先利其器，提取FFPE是所有研究开始的第一步。目前市场上有多种提取试剂盒，选择合适的试剂盒才能保证实验的成功率。

为避免有机溶剂的危害，提高核酸提取效率，解决行业痛点，凡知医学自主研发生产的FFPE样本核酸提取试剂盒，利用超顺磁性微球对核酸的选择性吸附，可实现DNA/RNA高质量提取；不含二甲苯、苯酚、氯仿等有毒有害物质；面对不同降解程度的FFPE片段，可最大限度的分离纯化高纯度的DNA/RNA；同时可适配核酸提取仪，进行自动化提取，简单高效，解放双手！