炎炎夏日来临，正当家长们暗自庆幸终于从“甲流、百日咳”的肆虐中熬过来时，手足口病的高发季又来了……

我国手足口病通常在每年的春夏季节高发，尤其是在5月至7月和9月至10月期间。这与手足口病病毒的传播途径和环境有关，这些病毒在潮湿、炎热的气候中更容易传播。此外，儿童和幼儿园中的人群密集，也是手足口病高发的原因之一。

2024年5月全国法定传染病疫情概况

（数据来源：国家疾控局官网）

2024年6月全国法定传染病疫情概况

（数据来源：国家疾控局官网）

一、手足口病简介

手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是一种由人肠道病毒引起的常见传染病，其中主要病原体为肠道病毒71(HEV-71)和柯萨奇病毒A16 (CAV-16)，世界大部分国家和地区均有此病流行的报道。

手足口病以手、足、口等部位散发性皮疹和疱疹为主，通过消化道、呼吸道和密切接触等途径。大部分患者预后良好，偶有重症可有后遗症，属于自限性疾病。手足口病有明显的季节性特点,夏秋季多见；患者主要为学龄前儿童,尤其是5岁以下儿童。

图1：手足口病感染症状

由于手足口病的传染性强、流行强度大且传播迅速，因此快速检测肠道病毒对于控制传染病具有重要意义。

二、手足口病结构

手足口病肠道病毒71、柯萨奇病毒A16 都是无包膜的小RNA病毒，直径在24~30nm之间，正二十面体对称，T=3（pseudo3）。病毒衣壳由60个相同的壳粒组成，构成衣壳的每个壳微粒都有四种壳蛋白，即VP1-VP4，均有抗原活性。如下图，VP1、2、3分布在表面，但是还有一个VP4在里面。

图2：肠道病毒病毒粒子结构示意

三、手足口病-病毒核酸提取方法

在病毒性病原体检测中，首先面临的问题就是核酸提取，如何从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸。对于临床标本就更需要严格的提取方法来保证核酸的稳定性，因为裸露的RNA在大部分实验室环境中是极易被核糖核酸酶降解的。因此，高质量的核酸提取方法的发展成为研究者最关注的问题。

核酸自1869年被人类首次发现以来，研究者们不断探索，在核酸的提取方法上已经有了卓越贡献，从液相法发展到了固相提取方法，从非磁性法发展到磁性法、从手工提取发展到自动化核酸提取。

常用液相法有十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)提取法、十二烷基磺酸钠(SDS)提取法、Chomczynski和Sacchi开发了传统的提取方法异硫氰酸胍--氯仿提取法。其中，CTAB法应用较为普遍。CTAB是一种非离子去污剂，可从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多糖，而蛋白质和中性多糖仍留在溶液中。在高离子强度溶液中，CTAB不会沉淀核酸，而是和蛋白质形成复合物。因此，CTAB常可用于从可产生大量多糖的有机体中纯化核酸，如植物和某些革兰阴性菌，该方法的后继步骤也是通过使用有机溶剂，乙醇等沉淀和去除蛋白质、盐以及其他污染物质。

实验室常用的固相提取法主要是离心柱吸附法，它不仅可以得到高纯度的核酸样本，还能避免有毒有机溶剂对人员的伤害，且操作流程与液相法相比较更加标准化，一般分为裂解、结合、洗涤、洗脱四步。固相法仍然需要离心，不能实现自动化高通量提取，耗时长。

综上所述，传统的核酸提取技术中所包含的沉淀和离心等技术步骤较为繁杂，费时长，成本偏高，很难实现自动化操作，不适合大量生物样本的核酸提取，此外还需要操作人员直接接触有毒的化学试剂。

近年来,核酸提取的发展方向是需要“高得率”即低拷贝数样本的检出和“高纯度”即无杂质，qRT-PCR反应不会被抑制的核酸；需要可靠的检验或诊断结果及其实现自动化、一体化。

为了适应现代分子生物学实验室检测高通量、高灵敏度、自动化操作需要，磁珠微球越来越受人们眼球的聚焦。使用磁珠进行核酸提取，即是使用磁性微球珠(300纳米-1微米)，在外磁场作用下选择性地结合的核酸，由于其自身兼具高分子微球和磁性粒子的众多特性，故在没有外加磁场的情况下在溶液中分散均匀、稳定，而一旦增加了外加磁场则可简单快速地分离。

在一般情况下，磁珠法核酸提取可以得到一致的DNA/RNA回收率，因为这些球状粒子可在溶液中充分重悬浮，使其更彻底地结合、洗涤和洗脱。与固相法，液相法相比，磁珠法核酸提取省去多次离心步骤，操作简单，高通量提取用时短，具有高效性、高特异性、高稳定性和自动化的特性，防止交叉污染。国内外也制造了很多相关的自动化核酸提取仪器及配套试剂。

四、病毒DNA/RNA磁珠法提取流程

图3：磁珠法核酸提取流程

1、裂解结合，去除蛋白：取蛋白酶K到EP管，加入待检样本、裂解液、异丙醇、磁珠悬液，充分涡旋混匀，并置于恒温震荡混匀仪，充分裂解病毒细胞并去除蛋白质。

2、洗涤，去除无机盐等杂质：待磁珠完全吸附，小心吸弃上清，避免吸弃磁珠。加入缓冲液WB1，震荡混匀30s，放置于磁力架上，待磁珠完全吸附，小心吸弃上清，避免吸弃磁珠。加入缓冲液WB2，震荡混匀30s，放置于磁力架上，待磁珠完全吸附，小心吸弃上清，避免吸弃磁珠。加入无水乙醇，震荡混匀30s，放置于磁力架上，待磁珠完全吸附，小心吸弃上清，避免吸弃磁珠。短暂离心，收集管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃管底部的液体，空气中干燥。

3、洗脱，得到纯化的核酸：加入洗脱液至离心管中，充分混匀磁珠，置于恒温震荡混匀仪，使核酸被充分洗脱。转移至磁力架上室温静置，待磁珠完全吸附，转移上清至新的离心管中。

4、核酸保存：保存于-20℃备用。

 

凡知医学--病毒核酸提取试剂

 

 

病毒 DNA/RNA 提取试剂盒

（磁珠法）

 

本产品采用自主研发的磁珠分离纯化技术和独特的裂解液与缓冲体系，可同时提取样本中的DNA/RNA。适用于多种临床样本病毒总核酸的提取，可直接用于下游分子生物学实验，包括PCR、反转录、RT-PCR、芯片检测等。

 

案例展示：

 

表1 提取效果展示

注释：以上表格里的6个样本均相同且等量，为掺入了灭活病毒培养物的猪血浆。

 

表2 提取效果展示

注释：以上表格里的样本均相同，为掺入了灭活病毒培养物的猪血浆。

 

 

配套提取仪展示

 

FireAuto96全自动核酸提取仪

 

 

 

 

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