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FFPE组织石蜡切片DNA提取重复性差，怎么办？

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随着多维度细胞及分子系统生物学等研究成果的发现，对有限组织样本提取DNA的要求越来越高。FFPE(Formalin-fixed,paraffin-embedded)是一种常见的组织制备方法，可使组织的结构保持完整，广泛应用于组织病理学，肿瘤学等。但在实践操作中，存在提取重复性差的问题。

图1：组织石蜡切片样本

FFPE DNA提取重复性低的原因：

FFPE技术无法控制不同样本的处理过程对样本的影响，这可能导致样本间差异性大，会影响结果的可靠性和数据分析的结果。

影响FFPE DNA提取的因素：

一般核酸提取纯化有三个质检指标：核酸浓度、核酸纯度及核酸完整度，而FFPE样本由于福尔马林处理，损伤核酸，影响下游应用数据的真实性，提高了核酸提取难度。

影响因素	结果
福尔马林固定使核酸与蛋白发生交联	影响核酸浓度与纯度
石蜡高温渗入过程加速磷酸二酯键的水解	导致核酸降解，影响完整性
福尔马林固定以及不理想的保存条件使胞嘧啶脱氨基引入C-T，G-A等突变	发生碱基突变，影响真实性
可能出现脱嘌呤和脱嘧啶的位点	无法产生碱基对，导致PCR扩增时模板断裂
福尔马林诱发DNA加合物生成，导致氨基间生成亚甲基桥	抑制双链DNA变性，影响PCR扩增效率

表1：影响FFPE样本中DNA质量的

因素及对应结果

如何让FFPE DNA提取重复性好？

1.脱蜡要彻底

为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子和尽量减少DNA额外损伤的前提下，对组织进行彻底地脱蜡。在此过程中，先溶解石蜡，然后去除，暴露样品，用于后续裂解缓冲液和蛋白酶K（如果合适）的处理。多种溶剂适用于脱蜡，如二甲苯、庚烷和柠檬烯等。

图2：组织石蜡切片

虽然二甲苯脱蜡法是目前最主流的脱蜡方法，并且被应用在绝大多数商业试剂盒中，但是它还是有一定的问题：

首先，二甲苯是一种有毒的有机试剂，在实验过程中如果身体接触到会有一定程度的危害，所以此实验是有一定风险的；

其次，切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。

最后，此脱蜡法的实验过程很繁琐，加上提取的步骤整个实验4小时左右，而且涉及到的试剂种类较多，容易出错。

所以各个公司都在积极研发更高效、安全、简易的解决方案来取代二甲苯脱蜡。

2.组织消化

为了将DNA与结合的蛋白质分离，FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止DNA发生降解。对消化时间进行优化十分重要。消化的时间过短，DNA的释放不充分，导致核酸提取的得率低。消化时间可以根据组织类型、组织大小进行调节，使DNA充分释放。

3.解交联

由于FFPE样品包含的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白分子交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。如果可能的话，因交联而引起的化学修饰也应当逆转，因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收，而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物。在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心，因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化。常用的解交联方法有热水解交联法、酸性解交联法、氨水解交联法、溶剂解交联法。

4.核酸的提取

核酸的提取有多种成熟的方法，包括抽提法、柱膜法、磁珠法等等，需要根据自己的实验需要选择。

凡知医学

组织石蜡切片基因组DNA提取试剂盒

（磁珠法）

凡知医学在FFPE样本领域具备丰富的研发经验，组织石蜡切片基因组DNA提取试剂盒（磁珠法）采用独特的无二甲苯的脱蜡配方裂解释放FFPE切片组织中的微量DNA，利用超顺磁性微球对核酸的选择性吸附实现高质量DNA的提取，保障了PCR、Sanger法基因测序、二代基因测序、基因芯片杂交等下游实验顺利进行。

1.技术优势

（1）脱蜡

组织石蜡切片基因组DNA提取试剂盒（磁珠法）采用无二甲苯的脱蜡配方裂解释放FFPE切片组织中的微量DNA，不仅没有二甲苯等有机试剂的毒性，而且更防止核酸降解，保证核酸的完整性，整个实验过程操作简便，高质量的DNA可提取良好支持下游测序。

（2）解交联

福尔马林的固定作用容易使核酸和蛋白质紧密交联，进行组织消化后样品已经变成水样状态，此时需要尽量在温和的环境下促进核酸和紧密交联的蛋白分开，释放DNA。为此，针对不同的下游实验，凡知有两种蛋白酶k消化方法，若下游实验是PCR，凡知建议在56℃，1小时孵育后升温至90℃继续孵育1h；若下游实验是二代测序，凡知建议60℃孵育4小时后，70℃过夜孵育处理。

（3）去除RNA

前期提取阶段不仅DNA得率要高，而且纯度和完整性也是下游实验关注的重点。核酸中的RNA会影响DNA的纯度，干扰下游实验的准确性。为此，凡知在FFPE DNA的提取实验中加入RNase A溶液，吹吸混匀后室温温育5 min，获取高纯度DNA。如果RNA不影响下游实验，可以不用消化掉RNA。

（4）高通量自动化提取程序运行

凡知医学的组织石蜡切片基因组DNA提取试剂盒（磁珠法）是基于磁珠法提取原理分离纯化DNA，操作简单，效率高，可兼容市面上的主流高通量自动化核酸提取仪，搭配凡知96通道核酸提取仪效率更高，方便省时有效降低成本。

2.提取优势

（1）脱蜡步骤：

A.采用无毒脱蜡剂;

B.操作简单，只需在裂解液中加入脱蜡剂，震荡混匀去蛋白，离心，去上层和中层的蜡成分。无需繁琐的乙醇水合步骤，大大节约脱蜡时间；

C.脱蜡步骤无需加热，常温即可。

（2）消化步骤：

把消化分为了两种情况，如果想得率高，可低温过夜消化，无需高温裂解，以比较温和的温度进行消化，减少DNA的降解。

（3）从结果看：得到的DNA中，大片段占比更高，缩小了小片段的占比。