分子诊断精准的核心密码——高特异性酶制剂『筛选指南』

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高保真聚合酶

普通Taq DNA聚合酶不具有外切核酸酶结构域，因此缺乏3´→5´外切核酸酶活性（又叫纠错/校对活性），不具备纠正功能，PCR反应的保真性较低，出现碱基错配的几率为2.1×10^-4左右，因此不宜使用在保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等等。

而高保真DNA聚合酶则具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性。在PCR扩增过程中，当引物与模板完全互补时，进入聚合域。在聚合酶活性的作用下，游离的脱氧核苷酸通过互补配对的原理依次与引物的3′端结合，新的DNA链从5′端向3′端延伸。

当引物末端结合的核苷酸未与模板配对时，错配的核苷酸会引起结构扰动。新的DNA链不能继续向前延伸，然后进入核酸外切酶结构域。在外切酶活性的作用下，错配的核苷酸被切除。切除后，核苷酸会正确重组，新的DNA链可以继续从5'延伸到3'。最终，可以精确复制新的DNA链。

影响实验成败的关键酶学性能：

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逆转录酶

逆转录酶(reverse transcriptase)又称RNA指导的DNA聚合酶，1970年由美国科学家特明和巴尔的摩分别于动物致癌RNA病毒中发现，他们因此获得了1975年度诺贝尔生理学或医学奖。

逆转录酶是多功能酶，具有三种酶活力：

逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶活性，以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录作用；具有3'→5'RNA外切酶活性（又称RNA酶H活性），能特异降解RNA-DNA杂交分子中的RNA部分；它还具有DNA指导的DNA聚合酶(DDDP)功能。

 

选择合适的酶

决定实验性能的并不只是酶，整个体系的缓冲液配方（盐，pH，Mg²⁺，稳定剂，加强剂，核苷酸等）的每一个组分都会影响反应的性能。只有当各组分优化地搭配在一起，才能发挥出酶的最大活性。凡知医学提供的酶原料均搭配优化好的先进缓冲液体系，最大程度简化优化过程，让好的酶达到最优的性能！