液体活检：游离DNA(cfDNA)检测技术及其在癌症早期诊断中的应用

游离DNA（cfDNA）是存在于人体细胞外液中的DNA片段，在生理或病理条件下（如妊娠、肿瘤等），cfDNA的含量变化和分子特征等使其成为疾病诊疗的生物标志物之一。随着cfDNA富集技术以及测序、质谱等检测技术的发展，cfDNA的检测已形成完整的检验流程。基于cfDNA检测的液体活检技术在临床肿瘤诊疗、产前检查中已得到广泛应用，并且在自身免疫病诊疗中展现出较大的潜力，是精准医疗和液体活检领域的重要方向之一。

在肿瘤领域，通过PCR及测序能够检测出血浆肿瘤cfDNA所携带的碱基突变、拷贝数变异等变异信息，以及肿瘤特有的甲基化异常及片段组学特征，可用于患者的诊断和筛查，并作为疗效评价及预后监测的手段。

现阶段cfDNA在肿瘤筛查中主要通过检测cfDNA携带的肿瘤特异性基因组信息和表观遗传学改变，以此分析患者的疾病种类、病情、治疗方案及预后。研究表明，肿瘤患者血液中的循环cfDNA，又称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），明显高于健康人群，且癌症晚期或转移性肿瘤患者的ctDNA含量远高于良性肿瘤或癌症早期患者。

目前临床上利用cfDNA检测进行癌症早期筛查的方式主要为DNA甲基化、突变、免疫化学等多组学联合分析，多靶点粪便DNA检测针对ctDNA中启动子甲基化、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene， KRAS）突变及血红蛋白含量进行分析，用于结直肠癌非侵入性筛查 ，血浆ctDNA甲基化SEPT9检测可与粪便免疫化学检测联合用于结直肠癌的筛查。另外，ctDNA突变位点结合8种可用于鉴别癌症的蛋白质生物标志物检测，在卵巢癌、肝癌等实体瘤的筛查中敏感度超过80%，特异度大于99%。

肿瘤晚期患者血液样本中携带突变的ctDNA含量显著上升，突变信息检测的准确度提高。2021年，国际肺癌研究协会批准ctDNA可作为非小细胞肺癌（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）晚期患者的诊断标志物，有助于NSCLC晚期患者的基因分型；2022年，国家综合癌症网络批准ctDNA作为胃癌、乳腺癌、转移性胰腺癌等肿瘤诊断和分型的替代标志^[1]。

 

研究案例

 

 

 

 

案例一

 

 

2024年3月14日，《新英格兰医学杂志》（NEJM）发布了关于结直肠癌无创筛查的最新研究成果-《A Cell-free DNA Blood-Based Test for Colorectal Cancer Screening》。其研究表明：基于血液游离 DNA（cfDNA）的筛查手段敏感性达 83.1%。这种筛查方法已于2024年7月26日正式获得FDA批准，用于筛查45岁及以上结直肠癌平均风险的人群。

 

基于血液游离DNA的试验检测结直肠癌的研究^[2]

 

 

案例二

 

 

2022年，发表在《Nature Communications》上的研究成果-《Genome-wide mutational signatures in low-coverage whole genome sequencing of cell-free DNA》。此研究对215名患者和227名健康人群的血浆进行全基因组测序（WGS），通过分析多种癌症（如肝癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌、肾癌等）患者的cfDNA，成功提取了与这些癌症类型相关的已知突变特征，证明了cfDNA的突变特征能够反映原发肿瘤的组织学来源，即“液体活检”可以揭示“组织溯源”信息，为利用cfDNA进行癌症早期筛查和风险评估提供了一种新的思路。

 

多种癌症类型的血浆基因突变特征检测^[3]

 

随着基于液体活检早检技术日趋成熟并进入临床应用，癌症的诊疗路径也将发生改变，基于液体活检的早检技术将作为传统癌症筛查方法的重要补充和筛查选择。

 

cfDNA在癌症患者的体液中可以被检测到，并且包含有关肿瘤的遗传和表观遗传信息，然而，目前的研究仍存在一些限制和挑战：

1.样本质量和量的限制：由于cfDNA的含量非常低，因此需要高灵敏度的检测方法，并且需要足够的样本量来进行分析。

2.特异性和灵敏度的限制：虽然cfDNA分析具有潜在的高特异性和高灵敏度，但在实际应用中，其特异性和灵敏度可能受到多种因素的影响，例如肿瘤类型、肿瘤早期阶段、采集和处理方法等。

3.数据分析和解释的复杂性：由于cfDNA中含有多种来源的DNA片段，因此需要对数据进行复杂的分析和解释，以区分来自肿瘤和正常细胞的cfDNA片段，并确定它们的组成和含量。

游离DNA是指游离于细胞外的DNA片段，存在于如血清、血浆、尿液、脑脊液、胸腹水等多种样本中。游离DNA的释放及含量受多种因素影响，在无细胞液体样本中具有片段化程度高、丰度低等特性。产量多质量高的游离DNA是进行检测的首要前提，因此，游离DNA的纯化提取步骤就显得尤为重要。

样本cfDNA的采集对后续检测至关重要。目前cfDNA的提取方法主要分为有机溶剂萃取法、核酸纯化柱分离法和磁珠提取法等。

1. 有机溶剂萃取法：有机溶剂萃取法以乙醇溶解法、苯酚氯仿法为主。该方法的优点是操作简便，成本低廉，但需要接触有毒溶剂，具有安全隐患。

2. 柱分离法：原理是在高浓度盐溶液下使样品中的cfDNA吸附在分离柱上，然后通过低浓度盐洗脱分离cfDNA。柱分离法的优点是提取率优于有机溶剂萃取法，携带变异信息的cfDNA丢失率更低，但需要反复离心，处理耗时较长。

3. 磁珠提取法：该方法首先将磁珠与预处理后的样本混合均匀，使片段长度与循环核小体长度相符合的cfDNA片段吸附在磁珠上，在外加磁场作用下使核酸快速分离，从而达到核酸纯化的目的。该方法操作简单，适用于处理大量样品。

近几年来，磁珠法开始应用于DNA的提取工作中，磁珠法中所采用磁珠一般都在纳米级别，拥有大比表面积。另外，磁珠表面修饰有特殊化学基团，在不同条件下可以对DNA分子形成特异性吸附或者解吸附作用，磁珠和小片段DNA的相互作用时间可控，再加上其本身拥有顺磁性的特性，富集DNA后与母液分离操作非常方便，这些特点都使得磁珠法能够成为更加便捷的cfDNA提纯方法。

凡知医学

血浆游离DNA提取试剂盒（磁珠法）